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并且取的蛋白点面积需要适当大一些(对于某些很小但很清晰的蛋白点
浏览: 发布日期:2019-07-24

  质谱技术在蛋白鉴定等实验中具有不可忽视的作用,。那么,有问题了怎么解决呢?本文收集了相关的新手对于这项技术的常见问题与解决方法。希望能更好地帮助大家了解这项技术。

  问题1. 一级质谱和二级质谱有什么区别?什么时候做一级,什么时候做二级?

  答:一级质谱鉴定的方式主要指胎指纹图谱(PMF),即利用质谱仪精确测量酶解片段的分子量并搜库比较实现蛋白质的鉴定,二级质谱是在一级质谱的基础上再选择部分肽段做进一步的破碎并对碎片进行深入分析和比较,鉴定出该肽段的序列并结合PMF的结果从而实现蛋白质的鉴定。二级质谱能够得到部分肽短的序列,具有更高的可靠性。随着现在杂志对数据的要求越来越严格,二级质谱鉴定是蛋白鉴定的大趋势,而且即使目前做一级质谱鉴定的结果,也需要挑选部分PMF结果做二级质谱验证。

  答:可以参考亲缘关系最近的模式生物做比对而实现蛋白质的成功鉴定,如果质谱图很好而没有鉴定结果说明这是一个全新的蛋白,可以采用de-novo等技术做深入分析与鉴定。

  答:做PMF一般得分超过60分(P0.05)就算成功鉴定,而串联质谱,得分超过60分或者虽然没有超过60分,但是有最少一条肽段的得分超过30分就算成功鉴定。

  答:质谱的其它用途包括磷酸化位点分析、蛋白测序、混合蛋白鉴定(shotgun技术)以及分子量精确测定、二硫键位置分析等等。

  答:最好用考马斯亮蓝法进行染色,银染也可以,但鉴定成功率稍低,并且推荐用串联质谱对银染蛋白进行鉴定可以大大提高鉴定成功率。

  答:如果保存时间超过一个月,可以用保鲜膜包裹后放入冰箱保持,如果小于一个月,则可以常温保持,不会影响质谱鉴定效果。

  答:取点的时候将0.2ml的枪头前端剪去一点,用枪头将凝胶戳取下来并转移至0.5ml离心管中,用水将胶粒反复吸打冲洗两至三次,最后吸干离心管中所有水分封盖保存。离心管最好用进口离心管,以免塑料污染;水最好用去离子水或者双蒸水;取点的时候带好口罩与手套,以免角蛋白污染。

  答:蛋白凝胶可以长期保存而不影响质谱鉴定效果,一般而言,如果在一两个星期以内,最好用保鲜膜包好,放到4度冰箱保存,如果保存时间超过一个月,可以把蛋白点取下后放入-20度或者-80度冰箱,不会影响后续质谱鉴定效果。运送胶点的时候采用常温运送即可,三五天内都不会有太大的影响。

  答:取点的时候将0.2ml的枪头前端剪去一点,用枪头将凝胶戳取下来并转移至0.5ml离心管中,用水将胶粒反复吸打冲洗两至三次,最后吸干离心管中所有水分封盖保存并做好标记。离心管最好用进口离心管,以免塑料污染;水最好用去离子水或者双蒸水;取点的时候带好口罩与手套,以免角蛋白污染。

  答:一级质谱的鉴定方法又常称为肽指纹图谱鉴定(peptide-mass mapping,PMF),二级质谱的鉴定方法又常称为串联质谱鉴定。早期蛋白鉴定,因为考虑鉴定成本的问题,一般做测序生物的蛋白鉴定可以选择一级质谱,而非测序生物常选择二级质谱。现在,二级质谱的价格也大大降低,和一级质谱并无太大差异,而且可靠性和鉴定成功率都大大提高,本公司一般都推荐客户(不管是研究测序生物还是非测序生物)直接做串联质谱,而不考虑进行肽指纹图谱鉴定。

  答:质谱鉴定主要包括蛋白酶解、质谱数据获取、对库检索三个步骤。针对每一个蛋白点的鉴定,一般会提供三种数据,具体包括:质谱图(PDF格式,包括1张一级质谱图和5-10张二级质谱图)、质谱峰列表(text格式,主要是一些质谱碎片的信息)、检索结果(自己建库进行本地化检索的一般提供的PDF格式或者excel格式,如果是Mascot在线检索的一般提供网页格式)。

  答:质谱鉴定不成功主要可以分为两类,一类是质谱效果不好,一类是没有可参考的蛋白数据库,质谱效果不好的原因又可以细分为蛋白点太淡以至于蛋白含量过低、蛋白点取得太小不利于操作、虽然经过双向电泳分离但却是某几个蛋白的混合蛋白点、蛋白酶解及质谱操作失误等,要避免这些因素需要尽量取颜色深一些的蛋白点,并且取的蛋白点面积需要适当大一些(对于某些很小但很清晰的蛋白点,取点的时候可是适当选择孔径大一些的枪头,把边上空白处适当取到一些也不要紧),避免取点可能混合的蛋白点,具备丰富的酶解质谱操作经验。而由于没有可参考的数据库导致的鉴定效果较差,可以通过更换范围更大的数据库、采用EST数据库以及根据单个物种的蛋白数据库构建本地质谱数据库的方式得到解决。

  答:质谱鉴定往往采用软件对已有数据库进行自动检索匹配得到结果,而质谱测序则需要根据质谱峰图中相邻或者相近峰的分子量差异直接推算出肽段的序列。

  答:现在比较简单的方法是质谱法,而且测一个样品价格也不高。具体价格各个实验室不一样,100-500元吧。如果质谱法不能确定的话还可以结合N端测序,可测10几个氨基酸。两个数据结合分析基本可以确定目的蛋白了,现在的蛋白质组数据库相当强大了。

  最后,小小地对以上的内容概括一下,质谱最好用考马斯亮蓝法进行染色,蛋白凝胶的保存时间大于一个月时,可将蛋白点取下后放在负二十度或者负八十度的环境中,随着技术的发展,当前二级质谱的价格与一级质谱相比差异不大,推荐直接做二级质谱。

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